In der Nacht, in der die Exponate des Naturhistorischen Museums lebendig wurden, hat Nachtwächter Larry Daley gerade erst in einer grandiosen Schlacht das ehrwürdige Museum vor dem Chaos bewahrt und gerettet, da muss er sich von dem neuen Job schon wieder verabschieden.
Alle Exponate müssen der neuesten Technik, nämlich virtuellen Hologrammen, weichen und werden zur Archivierung ins Smithsonian National Archiv in Washington DC verschickt. 

Doch nicht einmal 24 Stunden später bekommt Larry einen Anruf von einem seiner ehemaligen Museumsstücke: Cowboy Jedadiah berichtet ihm, dass aus Versehen auch die Tafel von Ahkmenrah, die die Exponate nachts zum Leben erweckt, mit nach Washington geschickt wurde und damit nun das komplette Smithsonian in der Nacht Kopf steht.
Larry reist eilig nach Washington DC, um sich dem Chaos zu stellen und seinen Freunden zu helfen. 

Eine neue Nacht bricht herein und neben Altbekannten wie Präsident Teddy Roosevelt trifft Larry dabei auf weitere interessante Persönlichkeiten der Geschichte: Den französischen Kaiser Napoleon Bonaparte, Albert Einstein, den Gangster Al Capone und den russischen Zaren Ivan der Schreckliche.