Er ist ein ganz normaler Junge. Peter Parker (Tobey Maguire) lebt mit seiner Tante May und seinem Onkel Ben (Rosemary Harris, Cliff Robertson) im New Yorker Stadtteil Queens, geht zur Schule, macht Fotos für die Schülerzeitung und schwärmt für die schöne Mary Jane Watson (Kirsten Dunst). Doch dann kommt der Tag, an dem sich sein Leben radikal ändert: Peter Parker wird von einer genetisch manipulierten Spinne gebissen. Und von nun an wird nichts mehr so sein, wie es mal war.

Schon bald bemerkt Peter die ersten körperlichen Veränderungen an sich: Er wird stärker. Geschmeidiger. Seine Sinne schärfen sich, wenn Gefahr droht. Er kann selbst die steilsten, glattesten Wände hochklettern und unglaubliche Distanzen überspringen. Und er ist in der Lage, Netzflüssigkeit abzusondern - Peter Parker hat die Kräfte einer Spinne.

Begeistert macht Peter das Beste aus seinen neuen Fähigkeiten: Geld. Als Wrestler will er mit diesen Kräften ein Vermögen verdienen. Doch dann stirbt sein geliebter Onkel Ben bei einem Überfall - und das Vermächtnis, das er seinem Neffen hinterlassen hat, wird Peters Schicksal bestimmen: "Mit großer Macht kommt große Verantwortung." Als Spider-Man widmet Peter Parker sein Leben dem Kampf gegen das Verbrechen. Und er ahnt nicht, dass sein schrecklichster Gegner direkt aus seinem Umfeld kommen wird.

Der ehrgeizige Großindustrielle Norman Osborn (Willem Dafoe), Vater von Peters Zimmergenossen Harry (James Franco), verändert sich plötzlich: Ein Experiment ist auf fatale Weise schief gegangen und hat dem Geschäftsmann körperlich und geistig übernatürliche Kräfte gegeben - ihn aber auch seines Verstandes und jeglicher Skrupel beraubt. Norman Osborn ist nun der Grüne Kobold. Der Superschurke wird zur Geißel von New York. Selbst Mary Jane und Tante May sind vor ihm nicht sicher. Nur einer kann die Zerstörungswut und Mordlust des Grünen Kobolds stoppen: Spider-Man …