Der Film beginnt mit einer Collage aus Szenen, Zeitungsausschnitten und Kommentaren über den Fall eines kleinen Mädchens namens Daisy Armstrong, das im Jahre 1930 in den USA aus dem Hause ihrer Eltern, reicher und hoch angesehener Bürger, entführt und nach Zahlung des Lösegeldes tot aufgefunden wird.

Fünf Jahre später: Der belgische Detektiv Hercule Poirot hat gerade in Jordanien einen Fall abgeschlossen und reist übers winterliche Istanbul zurück nach London. Als er ein Abteil im Kurswagen Istanbul-Calais des nächsten Orient-Expresses buchen will, stellt sich heraus, dass der Zug ausgebucht ist. Mit Hilfe seines Freundes Signor Bianchi, des Direktors der Eisenbahngesellschaft, bekommt Poirot doch noch einen Platz im Schlafwagen. Im Speisewagen macht ihm der US-amerikanische Geschäftsmann Samuel Edward Ratchett folgendes Angebot: Poirot solle ihn für sehr viel Geld bewachen, denn er erhalte regelmäßig Morddrohungen und schlafe mit einer Waffe unter dem Kissen. Poirot lehnt das Angebot ab. Nachts wird Poirot mehrmals von merkwürdigen Geräuschen geweckt. Mitten in der Nacht zwischen Vinkovci und Brod in Jugoslawien wird Ratchett durch zwölf Messerstiche ermordet und am Morgen tot aufgefunden.

Der Expresszug ist inzwischen auf freier Strecke auf jugoslawischem Gebiet im Schnee steckengeblieben. Keiner kann den Zug verlassen, auch der Mörder nicht. Der Telegraf streikt, und die jugoslawische Polizei kann nicht benachrichtigt werden. Daher bittet Signor Bianchi, der sich ebenfalls im Zug befindet, Hercule Poirot um die Aufklärung des Falles. Im Abteil des Toten findet Poirot einen fast verbrannten Brief, aus dem er auf die wahre Identität des Toten schließen kann. Es handelt sich um den Verbrecher Cassetti, der die kleine Daisy Armstrong entführt hatte und schuld an ihrer Ermordung und in der Folge an weiteren Todesopfern ist, sich aber der gerechten Strafe in den USA entziehen konnte.

Cassetti/Ratchett wurde mit zwölf Stichen getötet und das Sonderbare daran ist: Die Stiche sind unterschiedlich tief und unterschiedlich kräftig ausgeführt worden. Am Tatort werden außerdem ein Taschentuch und ein Pfeifenreiniger gefunden und in einem der Koffer der Mitreisenden die Uniform eines Schlafwagenschaffners.

Alle Menschen im Zug werden verhört, aber es befindet sich niemand an Bord, der zugibt, den gefundenen Pfeifenreiniger und das Taschentuch zu besitzen.

Poirot hat den Verdacht, dass alle Zuginsassen unter einer Decke stecken.