Nach den chaotischen Museumsnächten mit den zum Leben erwachten historischen Figuren, muss sich Larry Daley (Ben Stiller) nun von seinen neuen Freunden verabschieden. Alle Ausstellungsstücke müssen der neusten Technik, nämlich virtuellen Hologrammen, weichen und werden ins weltweit größte Museum, das Smithsonian in Washington, verschickt.

Doch nicht einmal 24 Stunden später bekommt Larry einen Anruf von einem seiner ehemaligen Museumsstücke: Cowboy Jedadiah (Owen Wilson) berichtet ihm, dass aus Versehen auch die Tafel von Ahkmenrah, die die Figuren nachts zum Leben erweckt, mit nach Washington geschickt wurde und damit nun das komplette Museum dort in der Nacht Kopf steht.

Eilig reist Larry nach Washington, um dem bösen Pharao Kahmunrah (Hank Azaria) und dessen Kumpanen Kaiser Napoleon (Alain Chabat), Al Capone (Jon Bernthal) und Ivan der Schreckliche (Christopher Guest) Einhalt zu gebieten.

Tatkräftige Unterstützung bei diesem Abenteuer bekommt er von der attraktiven Flieger-Pionierin Amelia Earhart (Amy Adams) und seinen alten Freunden wie Präsident Teddy Roosevelt (Robin Williams), die, ebenfalls zum Leben erwacht, mit ihm versuchen, den Tumult in Zaum zu halten…

Dies ist die erste Filmproduktion, die in dem weltweit größten Museumsarchiv Smithsonian gedreht wurde. Das Smithsonian liegt in Washington und beherbergt mehr als 136 Millionen Exponate.