Im dritten Teil von Spider-Man hat Peter Parker (Tobey Maguire) es endlich geschafft, seine Liebe zu Mary Jane (Kirsten Dunst) und seine Pflichten als Superheld in Einklang zu bringen. Doch schon ziehen am Horizont dunkle Wolken auf. Als sich Spider-Mans Anzug plötzlich pechschwarz verfärbt und ihm neue, ungeahnte Kräfte verleiht, verändert dies auch Peter und bringt die dunklen, rachsüchtigen Seiten seines Charakters ans Licht, Eigenschaften, die Peter bald nicht mehr kontrollieren und beherrschen kann. Unter dem Einfluss des Anzugs wird Peters Ego immer größer. Dabei vernachlässigt er zunehmend all die Menschen, denen er am meisten am Herzen liegt. Bald ist Peter gezwungen, sich zwischen der verführerischen Kraft des neuen Anzugs und dem mitfühlenden Helden, der er einst war, zu entscheiden. Peter muss seine persönlichen Dämonen bezwingen, während zwei der meist gefürchteten Schurken, Sandman (Thomas Haden Church) und Venom (Topher Grace), beispiellose Macht erlangen und in ihrer Rachsucht Peter und jeden, den er liebt, bedrohen.