Der Film spielt während des Ersten Weltkriegs in Deutsch-Ostafrika. In einer kleinen Siedlung, weit entfernt von jeder Zivilisation, lebt und wirkt die sittenstrenge und etwas altjüngferliche Rose Sayer als Missionarin zusammen mit ihrem Bruder Pastor Samuel Sayer. Mit dem Nötigsten und mit Nachrichten versorgt wird die Siedlung von dem rauhbeinigen und verwahrlosten Kapitän Charlie Allnutt und seinem altersschwachen kleinen Dampfboot namens „African Queen“. Niemand erwartet, dass der Krieg große Auswirkungen auf die Siedlung haben könnte, sie wird aber durch deutsches Militär bei einer Strafexpedition völlig zerstört und anschließend stirbt der dadurch verwirrte Bruder von Rose.

Kapitän Allnutt sieht sich gezwungen, Rose auf seiner Reise weiter den Fluss hinunter mitzunehmen. Das Zusammenleben dieser beiden unterschiedlichen Charaktere auf engstem Raum ist naturgemäß nicht einfach. Die spröde und strenge Rose macht Charlie das Leben schwer, zwingt ihn aus seiner Verwahrlosung heraus und schüttet eines Tages seine kompletten Vorräte an Gin über Bord. Sie zeigt aber auch unvermutete Stärke und Mut, mit dem sie langsam Charlie ansteckt und ihn aus seiner eher resignierten Haltung herausholt. Sie hat sich in den Kopf gesetzt, den Fluss ganz hinunterzufahren, obwohl dies als unmöglich gilt, und das im anschließenden See kreuzende deutsche Schiff zu versenken. Gemeinsam machen sich die beiden daran, diese Idee in die Tat umzusetzen, denn sie haben sich inzwischen sehr behutsam einander angenähert und sind nun ein Liebespaar.

Charlie leert zwei an Bord befindliche Sauerstoffflaschen, befüllt sie mit Sprengstoff, den er ebenfalls an Bord hat, und baut so zwei „Torpedos“, die er später am Bug der African Queen befestigt. Die Aufschlagzünder bastelt er aus etwas Holz, ein paar Nägeln und ein paar Patronen.

Die Schwierigkeiten, mit denen die beiden zu kämpfen haben, sind fast unüberwindlich. Eine deutsche Stellung, an der sie sich vorbeimogeln müssen, als unpassierbar geltende Stromschnellen (hier wächst Rose über sich hinaus und steuert das Boot, während Charlie sich um die unzuverlässige Maschine kümmern muss) bis hin zu einem Labyrinth von seichten Verzweigungen in der Flussmündung voller Rohrbewuchs, Mücken und Blutegel, in denen Charlie das Schiff bis zur völligen Erschöpfung von Hand schleppen muss. Er findet keinen Ausweg aus dem Labyrinth, beide schlafen erschöpft und ohne Hoffnung ein.

Nachts setzt starker Regen ein, der Wasserstand des Flusses steigt. Als die beiden aufwachen, bewegt sich das Boot von selbst in einer nun vorhandenen Strömung auf den See zu. Sie präparieren die „African Queen“, indem sie die „Torpedos“ durch Löcher im Bug schieben und somit scharf machen. In der Nacht ihres geplanten Angriffes herrscht auf dem See starker Sturm. Das Boot ist im Bug durch die Löcher so voll gelaufen, dass es nicht mehr zu steuern ist. Es beginnt zu sinken und kentert schließlich. Rose und Charlie klammern sich am Boot fest, plötzlich ist Rose verschwunden.

Als nächstes sieht man Charlie, wie er offensichtlich an Bord des deutschen Schiffes verhört wird. Es handelt sich um eine „Gerichtsverhandlung“, in der er schließlich als Spion zum Tode verurteilt wird, obwohl er behauptet, er sei nur als Angler auf der Insel gewesen, auf der man ihn aufgefunden hat.

Plötzlich legt ein Beiboot an und Rose wird ebenfalls an Bord gebracht. Charlie verleugnet sie zunächst. Rose will sich aber wenigstens die Genugtuung verschaffen, den Deutschen von ihrer beider Vorhaben zu erzählen, was natürlich auf Unglauben stößt, denn der Fluss gilt als unbefahrbar, und ihre Beschreibung der Torpedos klingt für die Deutschen auch nicht gerade überzeugend.

Auf jeden Fall sollen beide gehängt werden. Rose bittet darum, dass sie gleichzeitig mit Charlie gehängt wird. Charlie bittet daraufhin den Kapitän, sie vor der Hinrichtung noch zu trauen, was dieser auch etwas widerstrebend tut. In dem Moment, wo die Seile langsam gestrafft werden, um die beiden zu hängen, erschüttert eine Explosion das Schiff, es gerät in Brand und sinkt sofort.

Rose und Charlie schwimmen unversehrt im See. Rose findet ein im Wasser treibendes Wrackstück aus dem Bug ihres Dampfbootes, auf dem „African Queen“ zu lesen ist. Den beiden wird klar, dass sie es doch noch geschafft haben. (In Zwischenschnitten hatte der Zuschauer schon immer mal die gekenterte African Queen mit ihren Torpedos an der Oberfläche des Sees treiben und die Königin Louisa auch darauf zusteuern sehen.)